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发布日期:2021-12-13 14:31:00

气相分析方法开发总结(精讲)

 

引言:方法开发是个复杂而又神秘的工程,往往需要扎实的理论知识储备,但同时也少不了经验的积累;对于方法开发,需要我们从多学科出发,分析仪器学、色谱学、药学、有机化学、分析化学等学科综合,也需要我们熟练掌握文献信息检索,从中吸取精华,同时不断去试错,下面就把我个人职业生涯的经验进行总结提炼,供同行一起学习探讨,有不足之处需要同行前辈予以指正。
一、确认开发工作内容
1.残留溶剂检测分析方法:GC-HS方法、GC直接进样方法
2.基因毒杂质检测分析方法
3.高沸点样品杂质分离与含量检测方法
二、信息收集
1.首先要确定待测物质的溶解性、极性、沸点,主要针对“溶剂残留”;
2.其次还需要确定样品的溶解性、热稳定性、极性、沸点、化学性质(酸碱)、物理属性(固体/液体/半固态)。
三、色谱柱使用选择指南(分离关键)

四、进样方法的选择
1.方法有:溶液直接进样法、顶空进样
①残留溶剂-HS:大多数是低沸点物质(醇/酯/烷烃/醚),90%以上采用顶空进样(GC-HS),清洁进样,基本不出杂峰(溶剂),原料不被破坏但经济费用高。
②残留溶剂-DS:5%及少数采用溶液直接进样(GC-DS),经济,但出杂峰多(主要原料破坏带入),易损坏色谱柱需清洁老化保护。
③开发选择考虑总结:

2.溶剂沸点过高(沸点大于180℃),且样品对热比较稳定首选溶液直接进样法;
3.溶剂沸点低(沸点小于150℃),且样品对热不稳定首选顶空进样法;
4.顶空进样法可消除因溶液直接进样会产生降解杂质峰而干扰目标峰(进样口温度大于200℃),采用顶空进样方法还可以减少对样品的预处理。
5.基因毒杂质方法开发,优先选择溶液直接进样法(限度低,主要考虑提高灵敏度);样品杂质分离选择使用溶液直接进样法。
6.对于基因毒杂质限度小于2ppm以下方法开发,优先选择GC-MS溶液直接进样法。
五、确定定量方法
1.外标法:残留溶剂、含量(准确)
2.内标法:残留溶剂(主要针对易挥发烷烃类)
3.面积归一化法:样品杂质分离及纯度
六、样品预处理方法
1.气相色谱仪能直接分析的样品通常是气体或液体,固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中,而且还要保证样品中不含GC不能分析的组分(如无机盐:进样口温度不能保证盐汽化),往往会聚集在进样口衬管或分流平板导致污染/堵塞,还有可能通过载气进入色谱柱中,损坏色谱柱的填料。
2.样品预处理/溶解原则:根据相似相溶原理。
3.样品分类:气体样品、液体样品、固体样品。
4.气体/液体样品预处理方法:
①直接进样分析(纯度分析与检测),如:甲烷、乙醇;
②脂溶性液体样品(杂质),通常需要用脂溶性有机溶剂溶解样品,如:甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、DMSO、DMF;
③进样方式:溶液直接进样、顶空进样。
5.固体样品(含盐)样品预处理方法:
①样品性质:易溶于水,难溶于有机溶剂,样品熔点高,难汽化,如:钠盐/钾盐/盐酸盐/硫酸盐/磷酸盐/富马酸盐;
②如果选择水作溶剂-尽量使用顶空进样方法;
③灵敏度不理想且限度低(1-10ppm)-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法来进行预处理样品,这样既可以溶液直接进样又可以顶空进样,检测杂质/残留/基因毒通用。
七、溶剂系统选择
1.如果是溶液直接进样法,优先考虑溶剂选择,溶解样品的溶剂和最大溶解限度;如果是顶空进样法,可根据样品和溶剂都能溶解;
2.原则上水溶性样品优先选择水,非水溶性样品可选择酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC;
3.溶液直接进样-样品溶剂选择考虑:
①化学稳定(水解/醇解),优先选择水(水溶性)/醇/酯(脂溶性)作为溶剂;反之选择烷烃、质子溶剂(万能溶剂:DMF、DMSO、NMP、DMAC);
②样品具有酸/碱性,但是检测残留溶剂或杂质也具备酸/碱性,可根据待测物质酸/碱性质选择酸碱中和样品;如盐酸/硫酸/富马酸盐等产品检测胺类,需要单独使用碱性溶剂进行中和解离,同样反之,如吡啶/钠/钾盐等产品检测酸类,需要单独使用酸性溶剂进行中和解离(具体溶剂选择,需要进行加标回收验证实验)。
③供试品溶液要澄清,不与样品及待测物质反应或结合。
4.顶空进样-样品溶剂选择考虑:
①化学稳定(水解/醇解),优先选择水(水溶性)作为溶剂;反之选择质子溶剂(万能溶剂:DMF、DMSO、NMP、DMAC);
②样品具有酸/碱性,同上“3.②”。
③样品溶解完全没要求,顶空进样气体(溶剂残留)。
5.对于低限度燃烧值大的物质,可选用盐析溶剂系统,如:苯残留、三氯甲烷。
6.样品溶解溶剂选择,也要考虑残留溶剂的溶解度(如:烷、醚类不溶解水)。
7.大部分溶剂系统优先选择DMSO、NMP、DMF,因为既能溶解样品又能溶解溶剂。
八、柱温开发研究
1.等温:对于溶剂个数小(1-3个),且各溶剂沸点差异不算很大,此时可选择等温法,比如50℃保持10-15分钟(适合残留溶剂检测、基因毒杂质检测、含量测定);
2.程序升温:对于溶剂个数多(大于5个),且各溶剂沸点差异较大,此时可选择程序升温法,比如40℃保持10分钟,以10℃/min速率升至180℃,保持5分钟(适用于产品杂质分离、残留溶剂检测);
3.极端分离:对于大部分沸点低溶剂(当使用DB-624)且考虑分析时长时,可选用低温程序升温法,比如初始35-40℃(分析环境一定要保证<25℃);
4.经典程序升温(残留溶剂、杂质分离):

九、顶空条件方法选择和研究
1.炉温(加热-顶空瓶平衡温度):
①以水为溶剂,温度选择范围75-90℃,最高选择90℃;
②以DMSO、DMF等为溶剂,温度选择范围80-145℃,最高选择140℃;温度过高要考虑高温时长导致溶剂反应降解产生新的未知杂峰;
③考虑温度过高有爆瓶危险,特别在使用盐析方法时(因为溶剂系统里水分存在)爆瓶概率增加;
④加热温度研究最高温度一般低于溶剂10℃(在考虑灵敏度情况下)。
2.定量环温度:温度要大于炉温10℃;
3.传输线温度:温度要大于定量环温度10℃;
4.顶空瓶(加热)平衡时间:根据大部分溶剂沸点,沸点都相对高平衡时间就长,沸点相当都低平衡时间就短;常规平衡时间为30-60分钟,经典平衡时间为30分钟。
十、检测器选用
1.90%分析方法工作优先选用FID检测器:含碳氢化合物
2.基因毒杂质选用FID-MS检测器
3.如含电负性基团(F/Cl/Br)且含CH量少,选用ECD电子捕获检测器,如三氯甲烷无H物质
4.含有非碳氢化合物组分时,且对检测灵敏度要求不高,通常选择TCD检测器,主要气体检测,如辅材:氮气
十一、方法建立
1.进样口温度:一般选择200-230℃,进样口温度要大于传输线温度,可根据样品性质研究选用中高温,如150-180℃(考虑样品不被热解);
2.检测器温度:一般230-260℃。检测器温度要大于进样口和色谱柱温度;
3.流速:3.0-5.0mL/min,经典流速为:4和5mL/min;
4.分流比:①5:1-50:1;②选择规则-响应值高大分流比,反之则小分流比;③经典分流比为5:1(顶空进样)和50:1(溶液直接进样);
5.进样量:顶空进样-1mL,溶液直接进样-0.2-1uL,也可根据进样峰型进行改进;
6.样品浓度/配制开发研究:
①顶空进样:0.2-1g(根据限度/灵敏度要求进行研究),对于大浓度要考察样品提取平衡;浓度一般控制在0.1-0.4g/mL(顶空装量控制在1-5mL);
②溶液直接进样:一定要考虑溶解完全,浓度可根据限度/灵敏度要求进行开发研究;一般控制在0.5-200mg/mL;
③开发研究合适的样品浓度,一定要根据杂质限度/灵敏度做相应研究调整。
7.对于杂质分离(溶液直接进样法),在方法开发同时也要考察残留问题,可增加清洗老化色谱柱方法程序,也可增加清洗进样针方法;还有对于对气相管路有吸附残留性质也可增加清洗程序(如胺类、>150℃高沸点物质),增加程序一定要作为分析方法的一部分,且一定要经过验证验收。
8.系统干扰考察研究:先走空白2针,样品1针、对照1针,查看空白、样品溶液的干扰情况,空白与样品应无干扰峰出现(方法验证-专属性),且对LOQ和LOD测试无干扰,基本能通过LOQ和LOD验证(方法好坏体现在系统与溶剂对测试的干扰);
9.最后进行100%加标回收测试,回收结果如果满足90%-105%,方法基本确定。
十二、分析方法评价
1.分析方法开发评价标准:
①空白考察:空白溶液无干扰峰出现,应该对测试无影响(最小干扰<LOD);
②分离度:最低分离度标准为,各相邻峰间分离度>2.0(最小1.5);
③LOQ:确认灵敏度(响应值)最小的2个,将LOQ试验出来,LOQ对应浓度是否合格(LOQ含量不得高于限度的50%),且LOQ的S/N要大于10;
④加标回收标准(90-110%);
⑤溶液稳定性:100%加标溶液考察0、2、4、8、24小时的稳定性,主要考察峰面积RSD%(n=5)以及各溶剂的回收率%。
结语:干一行爱一行!冰冻三尺非一日之寒!需要我们不断学习探究,不断去实践不断扎实自己,对GC方法开发同时也需要我们扎实的仪器分析基本功,对GC色谱理论知识的剖析和挖掘,更要我们对GC仪器的熟练操作能力,这样我们的工作会事半功倍。
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